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Einleitungnephrolithiasis (NL) ist die zweithäufigste Nierenerkrankung nach Bluthochdruck betrifft bis zu 10% der Menschen weltweit, und in kannst du viagra rezeptfrei kaufen fast allen Ländern wird berichtet, dass ihre Prävalenz und Inzidenz steigt.1 NL tritt häufig auf und ist eine der Hauptursachen für Schmerzen, Behinderungen und Ausfalltage von Patienten. Es ist auch mit einem erhöhten Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Knochendemineralisation und Knochenbrüche, chronische Nierenerkrankungen und Nierenerkrankungen im Endstadium verbunden.2â"4Die überwiegende Mehrheit der Nierensteine besteht aus Kalziumoxalat.5 Selbst ein geringer Anstieg des Oxalats im Urin fördert die Calciumoxalatkristallbildung deutlich,6â "8 und daher ist Hyperoxalurie ein Hauptrisikofaktor für Nierensteine.7 Das im Urin gefundene Oxalat ist entweder exogenen oder endogenen Ursprungs. Diätetisches Oxalat, das fast 50% des im Urin ausgeschiedenen Oxalats ausmacht9, ist in pflanzlichen und tierischen Quellen reichlich vorhanden, wird vom Darm aufgenommen und unverändert im Urin ausgeschieden.9 Darüber hinaus tritt in der Leber eine endogene Oxalatproduktion auf, die aus dem Metabolismus von Glyoxylat resultiert.10 11 Die primäre Hyperoxalurie kannst du viagra rezeptfrei kaufen (PH) ist eine vererbte autosomal-rezessive Stoffwechselstörung, die auf eine erhöhte endogene Oxalatproduktion zurückzuführen ist, während die sekundäre Hyperoxalurie erworben und durch eine übermäßige Aufnahme von Oxalat oder Oxalatvorläufern aus der Nahrung oder durch Faktoren verursacht wird, die die Nettooxalatresorption durch den Magen-Darm-Trakt erhöhen können (z. B. Kalziumarme Ernährung, Lipidmalabsorption und abnormales Mikrobiom).

Daher ist die Identifizierung der möglichen Mechanismen, die zu Hyperoxalurie führen, ein wichtiger Schritt kannst du viagra rezeptfrei kaufen zur Optimierung der Versorgung und Behandlung von oxalatabhängiger NL.Bei Mäusen verursacht die Ablation des Oxalattransporters SLC26A6 einen Defekt in der intestinalen Oxalatsekretion, der zu einer erhöhten Nettoabsorption von Oxalat aus der Nahrung führt,12 was zu Hyperoxalurie und Calciumoxalat NL führt.12 13 Diese Beobachtung unterstützt die Möglichkeit, dass eine zusätzliche Art von vererbter Hyperoxalurie bei menschlichen Patienten aufgrund von Mutationen, die zu einer gestörten intestinalen Oxalatsekretion führen, existieren könnte, was zu einer erhöhten Netto-intestinalen Absorption von Oxalat führt. Vier Studien haben die Auswirkungen von SLC26A6-Varianten beim Menschen untersucht.14â "17 Diese Studien berichteten jedoch entweder über keine Assoziation von SLC26A6-Varianten mit Hyperoxalurie oder mit NL,14â "16 oder berichteten über Mutationen, die einen Komplex zwischen SLC26A6 und dem Citrat-Transporter NaDC-1 stören, wodurch Hypocitraturie als Risikofaktor für NL verursacht wird.17 Daher wurde bisher keine seltene humane SLC26A6-Variante berichtet, die zu Hyperoxalurie beiträgt.Hier, Wir berichten über eine Familie, in der eine seltene heterozygote Missense-Mutation im SLC26A6-Gen mit Hyperoxalurie und rezidivierendem bilateralem Calciumoxalat-NL assoziiert ist. Die In-vitro-Charakterisierung der Mutante zeigte, dass die Mutation zu einer defekten Membranexpression und Oxalattransportaktivität führt, wobei ein dominanter negativer Effekt auf den Wildtyp (WT)-Transporter nachgewiesen wurde. Wir schließen daraus, dass seltene, schädliche Mutationen kannst du viagra rezeptfrei kaufen im SLC26A6-Gen eine mögliche Ursache für vererbte Hyperoxalurie sind und daher NL beim Menschen fördern können.Prägnante Methodeneine detaillierte Beschreibung von Material und Methoden ist als Online-Zusatzinformation verfügbar.Ergänzungsmaterialteilnehmer der UK Biobank analysierten bis zu 200â619 Proben mit verfügbaren Exomsequenzierungsdaten. Diese Forschung ist Teil der britischen Biobank-Forschungsanwendung # 67â 575.

Die in dieser Studie verwendete Strategie zur Identifizierung von Patienten mit Nierensteinen wird in ergänzenden Online-Materialien beschrieben.DNA-Sequenzanalysender DNA-Proband wurde durch Ganz-Exom-Sequenzierung auf der Genotypisierungsplattform des Europäischen Genomischen Instituts für Diabetes (Lille, Frankreich) bewertet. Zu diesem Zweck verwendeten wir das Human Core kannst du viagra rezeptfrei kaufen Exome EF Multiplex Complete Kit (Twist Bioscience) in Kombination mit Illumina Next-Generation Sequencing.Die SLC26A6-Mutation wurde im Probanden durch Sanger-Sequenzierung bestätigt und dann in den Familienmitgliedern bewertet. Primersequenzen und PCR-Bedingungen sind auf Anfrage erhältlich. Fragmente wurden in beide Richtungen sequenziert und anschließend mit dem 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems) analysiert. Elektropherogrammablesungen wurden unter Verwendung kannst du viagra rezeptfrei kaufen der SeqScape-Software (Applied Biosystems) zusammengestellt und untersucht.Nachweis von Varianten in der britischen Biobank Wir verwendeten Exomdaten aus dem pVCF-Format (Feld # 23 156).

Nur Varianten mit einer Abdeckung von mehr als 10 Lesungen und einem Qualitätsgenotypqualitätswert (GQ) von mehr als 20 wurden für weitere Analysen aufbewahrt. Die Annotation der Varianten erfolgte mit dem Ensembl Variant Effect Predictor Tool V.103 (RefSeq).In-silico-Analysen der Auswirkungen der p.R507W-Mutation auf das Slc26a6-Proteinein Strukturmodell des humanen SLC26A6 wurde unter Verwendung der experimentellen Struktur des Homodimer-Anionentransporters SLC26A9 der Maus als Strukturvorlage entwickelt.18 Verschiedene strukturelle bioinformatische Ansätze wurden verwendet, um die Modellstruktur und den Aminosäureaustausch zu untersuchen, einschließlich der Berechnung von ÎÎ G-Werten zwischen dem WT und den Variantenproteinen. Die verschiedenen Ansätze und zusätzliche Strukturanalysen werden im Abschnitt kannst du viagra rezeptfrei kaufen Online-Ergänzungsmaterial beschrieben.SLC26A6-Expressionskonstrukteein HA-markiertes Wildtyp-humanes SLC26A6-cDNA-Expressionskonstrukt (HA-WT) 19 wurde verwendet, um HA-markiertes und myc-markiertes p zu erzeugen.R507W humane SLC26A6-Mutanten (HA-MT bzw. Myc-MT) mit einem Q5-Mutagenese-Kit (New England Biolabs).Zellkultur und Transfektionenokp-Zellen (American Type Culture Collection (ATTC)) wurden für alle Transfektionsexperimente verwendet. 1Ã105âOKP-Zellen pro Vertiefung einer Zellkulturschale mit 24 Vertiefungen wurden reverse transient mit 2âÂµL Lipofectamine 2000 (Thermo Scientific) und 0,1â0,25âÂµg HA-WT-, myc-WT- oder HA-MT-cDNA transfiziert, wie in der jeweiligen Abbildungslegende für jedes Experiment angegeben.

Die Zellen wurden kannst du viagra rezeptfrei kaufen 72 Stunden nach der Transfektion getestet.Zelloberflächenbiotinylierungsokp-Zellen wurden 72 Stunden nach der Transfektion oberflächenbiotinyliert, wie zuvor beschrieben.19 Membranen wurden mit einem polyklonalen Kaninchen-Anti-SLC26A6-Antikörper19 (R29. 1:50â 000 Verdünnung), einem polyklonalen Kaninchen-Anti-HA-Antikörper (71â5500. 1:250 Verdünnung. Thermo Scientific) oder einem monoklonalen kannst du viagra rezeptfrei kaufen Maus-Anti-Myc-Antikörper (R950-25. 1:5000 Verdünnung.

Thermo Scientific) untersucht. Die primäre Antikörpermarkierung wurde entweder mit einer kannst du viagra rezeptfrei kaufen Esel-Antikaninchen- oder einer Esel-Antimaus-Meerrettich-Peroxydase (HRP-markierter Sekundärantikörper (711-035-152 bzw. 715-035-150. 1)) nachgewiesen:20â000 Verdünnung kannst du viagra rezeptfrei kaufen. Jackson ImmunoResearch),19 visualisiert durch verstärkte Chemilumineszenz (Clarity Western ECL Substrat.

Bio-Rad) und auf Film aufgezeichnet.Koimmunpräzipitationstransfizierte OKP-Zellen wurden vor der Solubilisierung mit 1% Digitonin 72 Stunden lang kultiviert. Myc-markiertes WT SLC26A6 wurde aus kannst du viagra rezeptfrei kaufen OKP-Zelldetergens-Lysaten mit dem Anti-myc-Antikörper R950-25 (Thermo. 5â Âµg IgG/mL Lysat) immunpräzipitiert. Immunpräzipitate wurden mit Protein G Sepharose Fast Flow (Sigma P3296) eingefangen, und dann wurden Sepharosekügelchen ausgiebig mit einer Reihe von normalen und hohen Salzwäschen gewaschen, um die unspezifische Bindung zu reduzieren. Immunpräzipitate wurden aus SepharoseKügelchen kannst du viagra rezeptfrei kaufen durch Inkubation mit 2Ã- Natriumdodecylsulfat (SDS)-PAGE-Probenpuffer, der 100â mm Dithiothreitol (DTT) enthielt, für 2âmin bei 100Â ° C freigesetzt.

Die Immunpräzipitate wurden einer SDS-PAGE unterzogen, auf ein Polyvinylidenfluorid (PVDF-Membran) übertragen und dann durch Western Blot mit Antikörpern analysiert, die gegen die HA-Epitop- und myc-Epitop-Tags gerichtet waren (71â 5500 bzw. R950-25-Antikörper).clâˆ '-abhängige 14C-Oxalataufnahme Siehe Referenznummer 19 für eine detaillierte Beschreibung der Begründung und Methodik für die Bewertung der clâˆ -gradientenabhängigen 14C-Oxalataufnahme, die durch die SLC26A6-Expressionskonstrukte (HA-WT und HA-MT) vermittelt wird, wenn sie in OKP-Zellen transfiziert werden. Kurz gesagt, Aufnahmen wurden für kannst du viagra rezeptfrei kaufen jede Transfektionsbedingung in Gegenwart und Abwesenheit eines nach außen gerichteten Chloridgradienten durchgeführt, um eine Schätzung des Anteils der gesamten 14C-Oxalatzellaufnahme zu liefern, der spezifisch chloridabhängig war. Die Aufnahme wurde auch in nicht-transfizierten Zellen (die nur dem Transfektionsreagenz ausgesetzt waren) durchgeführt, um eine Schätzung der Hintergrundspiegel der endogenen chloridabhängigen 14C-Oxalataufnahme zu liefern. Die Hintergrundwerte wurden dann von den Werten in transfizierten Zellen subtrahiert, um den Grad der chloridabhängigen 14C-Oxalataufnahme zu bestimmen, der direkt und ausschließlich auf die Aktivität der transfizierten SLC26A6-Expressionskonstrukte zurückzuführen ist.Statistikdatenwerte werden als Mittelwertâ±SEM dargestellt.

Die statistische Signifikanz wurde durch ungepaarten zweiseitigen Studentâ s t-Test (GraphPad kannst du viagra rezeptfrei kaufen Prism) bewertet.Ergebnissprimärklinische Daten des Probandendie Patientin ist eine spätjugendliche Frau von nicht blutsverwandten Eltern. Sie hat eine persönliche Vorgeschichte von Hashimotoâ s Thyreoiditis, die während ihrer frühen Jugend diagnostiziert und durch L-Thyroxin ersetzt wurde. Sie hatte ihre erste Nierenkolik in ihrer frühen Jugend. Seitdem litt kannst du viagra rezeptfrei kaufen sie an wiederkehrenden Nierenkoliken (>20) und bestand mehrere Nierensteine. Abdominal-CT und uasound detektierten multiple und bilaterale Steine ohne Nephrokalzinose (Online-Ergänzungsabbildung S1).

Ein spontan evakuierter Nierenstein wurde mittels Infrarotspektrometrie analysiert, was eine Zusammensetzung von Calciumoxalatmonohydrat (~ 80% Whewellit) ergab, die darauf hindeutet, dass NL oxalatabhängig ist. Biochemische Analysen, kannst du viagra rezeptfrei kaufen die unbehandelt und 2âMonate nach ihrer letzten Nierenkolik durchgeführt wurden (Tabelle 1), identifizierten das Vorliegen einer offenen Hyperoxalurie (733âÂµmol / Tag, N. 40â330), die bei einer zweiten unabhängigen Urinprobe bestätigt wurde (800âÂµmol/ Tag, N. 40â330). Die Angemessenheit der Urinsammlung wurde durch kannst du viagra rezeptfrei kaufen Messung der täglichen Kreatininausscheidung (0,16 â mmol / kg / Tag, N.

0,12 â 0,19) bestätigt. Ein Interview mit einem Ernährungsberater schloss eine übermäßige Aufnahme von oxalatreichen Nahrungsmitteln (~ 50â mg / Tag) aus und ergab eine sehr geringe Kalziumaufnahme (~ 400â mg / Tag). Der Patient hatte keine Darmerkrankung oder Durchfall in der Anamnese und zeigte keine kannst du viagra rezeptfrei kaufen Anzeichen einer Malabsorption. Tabelle 1 zeigte auch keine biologischen Hinweise auf Malabsorption. Nierensteinverursachende Erkrankungen wie kannst du viagra rezeptfrei kaufen Vitamin-D-Überschuss oder primäre systemische Erkrankungen (z.

B. Primärer Hyperparathyreoidismus oder Nierenleckage von Phosphat) wurden ausgeschlossen. Der Kalziumbelastungstest ergab eine erhöhte Verdauungsabsorption von Kalzium, was durch das kannst du viagra rezeptfrei kaufen erhöhte Delta zwischen Postkalziumbelastungskalziurie und Nüchternkalziurie belegt wird. Der Patient zeigte jedoch keine Hyperkalziurie. Der einzige andere Risikofaktor für NL war eine sehr leichte Hypocitraturie (1,18âmmol/24âStunden, N>1,67).

Der Patient zeigte keine extrarenalen Symptome oder biologischen Anomalien, die kannst du viagra rezeptfrei kaufen auf eine systemische Oxalose hindeuteten, und die Nierenfunktion schien normal zu sein.Ergänzendes materialIn-silico-Analyse der mutmaßlichen Auswirkungen der R507W-Substitution auf die SLC26A6-Proteinstruktur. Die beiden Untereinheiten werden dargestellt, wobei eine Untereinheit grün und die andere orange gefärbt ist (Cartoon-Darstellung). Die Olivenkugeln stellen die Grenze der Lipiddoppelschicht dar, wie sie mit dem PPM-Server berechnet wurde. Eine Zone, von der vorhergesagt wird, dass sie mit dem clâˆ -Ion interagiert, wie es in der experimentellen Struktur SLC26A9 der Maus vorgeschlagen wurde, wird zur Orientierung durch einen schwarzen gestrichelten Kreis in der kannst du viagra rezeptfrei kaufen Untereinheit a hervorgehoben. R507-Reste beider Untereinheiten sind markiert und blau eingefärbt.

Dieser Rest befindet sich auf der letzten Helix der Transmembrandomäne 22 Reste vor Beginn des Sulfattransporter-Antagonisten des Anti-Sigma-Faktors (STAS-Domäne. Die Einfügeschlaufe, die nicht kannst du viagra rezeptfrei kaufen erstellt werden konnte, ist als gestrichelte Linie dargestellt. Es wird erwartet, dass die Mutation das Protein destabilisiert und eine optimale Insertion in die Lipiddoppelschicht behindert." data-icon-position data-hide-link-title="0">Abbildung 1 In-silico-Analyse der mutmaßlichen Auswirkungen der R507W-Substitution auf die SLC26A6-Proteinstruktur. Die beiden Untereinheiten werden dargestellt, wobei eine Untereinheit grün und die andere orange gefärbt ist (Cartoon-Darstellung). Die Olivenkugeln stellen kannst du viagra rezeptfrei kaufen die Grenze der Lipiddoppelschicht dar, wie sie mit dem PPM-Server berechnet wurde.

Eine Zone, von der vorhergesagt wird, dass sie mit dem clâˆ -Ion interagiert, wie es in der experimentellen Struktur SLC26A9 der Maus vorgeschlagen wurde, wird zur Orientierung durch einen schwarzen gestrichelten Kreis in der Untereinheit a hervorgehoben. R507-Reste beider Untereinheiten sind markiert und blau eingefärbt. Dieser Rest befindet sich auf der letzten Helix der Transmembrandomäne 22 kannst du viagra rezeptfrei kaufen Reste vor Beginn des Sulfattransporter-Antagonisten des Anti-Sigma-Faktors (STAS-Domäne. Die Einfügeschlaufe, die nicht erstellt werden konnte, ist als gestrichelte Linie dargestellt. Es wird erwartet, dass die Mutation das Protein destabilisiert und eine optimale Insertion in die Lipiddoppelschicht behindert.Diese Tabelle anzeigen:Tabelle 1 Merkmale, Blut- und Urinanalysen und Calciumbelastungstest der Patientenidentifizierung einer seltenen heterozygoten Missense-Mutation in SLC26A6DURCH Gesamt-Exom-Sequenzierung der Probandâ s-DNA untersuchten wir seltene kodierende Varianten von potenziellem Interesse mit geringer Allelhäufigkeit unter 0,1% in der Genomaggregationsdatenbank (GnomAD V.2.1.1) in einer Liste von Genen oder Kandidatengenen, die mit NL verknüpft sind (Online-Ergänzungstabelle 1).

Wir fanden keine pathogene oder wahrscheinlich pathogene Variante nach den Kriterien des American College of Medical Genetics kannst du viagra rezeptfrei kaufen and Genomics.20âIn den drei an der PH beteiligten Genen wurde keine pathogene oder wahrscheinlich pathogene Variante oder Variante unbekannter Signifikanz nachgewiesen. Wir fanden jedoch eine seltene heterozygote Variante unbekannter Signifikanz im 13. Kodierenden Exon von SLC26A6 (NM_022911.2. C.1519C>T. P.R507W).

SLC26A6 kodiert einen Oxalattransporter, der an Hyperoxalurie und NL beteiligt ist, basierend auf Knockout-Studien an Mäusen.12 13 Laut GnomAD (V.2.1.1) ist SLC26A6 intolerant gegenüber Funktionsverlustvariationen mit einem beobachteten / erwarteten Wert von 0,65 (0,48 â 0,91), und der p.Die R507W-Mutation ist sehr selten, da sie in nur 5 von 280â 674 in GnomAD (in Europäern und Südasiaten) gemeldeten Allelen gefunden wurde. Laut SIFT, Mutation Taster und PolyPhen-2 (HumDiv) wurde vorhergesagt, dass die p.R507W-Mutation schädlich, krankheitsverursachend bzw. Schädlich ist.21â "23zusatzmaterialmenschlicher SLC26A6-Rückstand p.R507 wurde in einem Interspeziesvergleich vollständig konserviert gefunden. Die Konservierung dieses Rückstands war auch in dieser Proteinfamilie sehr hoch (dh die Punktzahl an Position 507 war gleich 8, das Maximum ist 9, über den Consurf-Server). Wir haben dann ein Homologiemodell erstellt, das als experimentelle Vorlage den Maus-Slc26a9-Homodimer-Anionentransporter dreidimensional verwendet (3D-Struktur (Abbildung 1)).

Die Modellierung war möglich, da die Gesamtsequenzidentität zwischen den beiden Proteinen bei etwa 40% liegt (siehe Online-Ergänzungsmaterialien).Die humane SLC26A6-Modellstruktur, die in einer Membran positioniert ist, ist in Abbildung 1 dargestellt. P.R507 befindet sich auf der C-terminalen Seite der letzten Transmembranhelix vor der STAS-Domäne. Es wird vorausgesagt, dass die Region von p.R507 im Wesentlichen starr ist (Prädyflexionsberechnung) und daher nicht sehr tolerant gegenüber dem p ist.R507W-Substitution, von der vorhergesagt wurde, dass sie wahrscheinlich die korrekte Wechselwirkung mit der Membran stört. Die Details unserer In-Silico-Analysen werden als Online-Ergänzungsmaterialien zur Verfügung gestellt.Familienuntersuchung der Slc26a6 p.R507W-Mutationda die SLC26A6-Mutation potentiell pathogen war, wurden beide Elternteile des Probanden untersucht. Sanger-Sequenzierung identifizierte die gleiche heterozygote SLC26A6-Mutation beim Vater, während die Mutter WT war (Online-Ergänzungsabbildung S2).

Die Mutter hatte keine persönliche oder familiäre Vorgeschichte von Nierensteinen und zeigte normale Oxalatspiegel im Urin (250âÂµmol / Tag, N. 40â 330).Charakterisierung der R507W SLC26A6-Mutation in transfizierten OKP-Zellen. OKP-Zellen wurden mit äquivalenten Mengen (0,1 â Âµg cDNA pro Vertiefung einer 24-Well-Schale) entweder Wildtyp- (WT. HA-WT) oder mutierter (MT. HA-MT) humaner SLC26A6-cDNA transfiziert.

Die Zellen wurden 72 Stunden nach der Transfektion getestet. Für jede Transfektion (Tx-1 bis 3) wurden Aufnahmen und Begleitbiotinylierungen in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Utx, nicht übertragene Kontrolle. Die Felder A + B zeigen repräsentative Bilder, die aus jeder Transfektion ausgewählt wurden. Western Blots wurden mit dem antihumanen polyklonalen Antikörper Slc26a6, R29, untersucht.

Panel A. Westliche Analyse von Gesamtzelllysaten, die aus jeder Transfektionsbedingung isoliert wurden. Tafel B. Westliche Analyse von biotinylierbarem hA6 auf der Zelloberfläche aus jeder Transfektionsbedingung. Tafel C.

Expressionsniveaus von insgesamt und Zelloberfläche biotinylierbarem hA6. Die Expressionsniveaus wurden densitometrisch bestimmt. Um Vergleiche zwischen Transfektionen (n = 3 unabhängige Transfektionen) zu erleichtern, wurden die MT-Expressionsniveaus für jede Transfektion auf mittlere Densitometriewerte für die WT-Densitometriewerte für jede Transfektion normalisiert. Alle WT-Werte werden als 100 (%) ausgedrückt, und die einzelnen MT-Werte variieren entsprechend. Tafel D.

Chloridabhängige 14C-Oxalataufnahme zurückzuführen auf transfizierten Wildtyp (WT. HA-WT) und Mutante (MT. HA-MT) Slc26a6. Die Aufnahmewerte werden als pmol 14C-Oxalat-Aufnahme pro Vertiefung einer 24-Vertiefungsplatte angegeben und sind nicht auf die Spiegel des exprimierten Proteins normalisiert. WT, Wildtyp.

HA-WT, Hämagglutinin-markierter Wildtyp. MT, Mutante. HA-MT, Hämagglutinin-markierte Mutante. Tx, Transfektion. Utx, nicht transfiziert." data-icon-position data-hide-link-title="0">Abbildung 2 Charakterisierung der R507W SLC26A6-Mutation in transfizierten OKP-Zellen.

OKP-Zellen wurden mit äquivalenten Mengen (0,1 â Âµg cDNA pro Vertiefung einer 24-Well-Schale) entweder Wildtyp- (WT. HA-WT) oder mutierter (MT. HA-MT) humaner SLC26A6-cDNA transfiziert. Die Zellen wurden 72 Stunden nach der Transfektion getestet. Für jede Transfektion (Tx-1 bis 3) wurden Aufnahmen und Begleitbiotinylierungen in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.

Utx, nicht übertragene Kontrolle. Die Felder A + B zeigen repräsentative Bilder, die aus jeder Transfektion ausgewählt wurden. Western Blots wurden mit dem antihumanen polyklonalen Antikörper Slc26a6, R29, untersucht. Panel A. Westliche Analyse von Gesamtzelllysaten, die aus jeder Transfektionsbedingung isoliert wurden.

Tafel B. Westliche Analyse von biotinylierbarem hA6 auf der Zelloberfläche aus jeder Transfektionsbedingung. Tafel C. Expressionsniveaus von insgesamt und Zelloberfläche biotinylierbarem hA6. Die Expressionsniveaus wurden densitometrisch bestimmt.

Um Vergleiche zwischen Transfektionen (n = 3 unabhängige Transfektionen) zu erleichtern, wurden die MT-Expressionsniveaus für jede Transfektion auf mittlere Densitometriewerte für die WT-Densitometriewerte für jede Transfektion normalisiert. Alle WT-Werte werden als 100 (%) ausgedrückt, und die einzelnen MT-Werte variieren entsprechend. Tafel D. Chloridabhängige 14C-Oxalataufnahme zurückzuführen auf transfizierten Wildtyp (WT. HA-WT) und Mutante (MT.

HA-MT) Slc26a6. Die Aufnahmewerte werden als pmol 14C-Oxalat-Aufnahme pro Vertiefung einer 24-Vertiefungsplatte angegeben und sind nicht auf die Spiegel des exprimierten Proteins normalisiert. WT, Wildtyp. HA-WT, Hämagglutinin-markierter Wildtyp. MT, Mutante.

HA-MT, Hämagglutinin-markierte Mutante. Tx, Transfektion. Utx, nicht transfiziert.Obwohl der Vater keine Nierenkolik meldete, ergaben biochemische Analysen, dass auch er eine Hyperoxalurie hatte (520âÂµmol/Tag, N. 40â330). Der Calciumbelastungstest war streng normal und für den Vater wurde kein anderer Risikofaktor für NL identifiziert (Tabelle 1).

Wir stellten jedoch fest, dass er einen Urinausstoß von fast 4â L / Tag aufwies, was eine sehr hohe Wasseraufnahme widerspiegelt. Diese hohe Urinausscheidung könnte erklären, warum er nie Nierensteine hatte. Außerdem zeigte er im Gegensatz zum Probanden keine Hypocitraturie. Keine anderen Verwandten derselben Familie waren für medizinische Untersuchungen und Gentests zugänglich.Ansprechen auf die medizinische Behandlungwir stellten die Hypothese auf, dass der Proband eine vererbte enterische Hyperoxalurie aufgrund einer mangelhaften SLC26A6-vermittelten Oxalatsekretion aufwies, was zu einer erhöhten Nettoabsorption von Oxalat aus der Nahrung führte. Wir rieten ihr, die Trinkwasseraufnahme zu erhöhen, um eine Harnausscheidung von mindestens 3â L / Tag zu erreichen, und systematisch jeder Mahlzeit ein Milchprodukt zuzusetzen, um ihre Kalziumaufnahme auf die empfohlenen Tagesmengen von 900â mg / Tag zu erhöhen.

Die letztgenannte Intervention erwies sich als sehr effektiv, da die Oxalatausscheidung im Urin bei wiederholten Kontrollanalysen deutlich von >700âÂµmol /Tag auf ~ 300âÂµmol /Tag abfiel, während die leichte Hypocitraturie anhielt (1,49âmmol / 24âStunden N<. 1,67). Es wurde keine andere Medikation eingeleitet, und NL verbesserte sich auch dramatisch, da sie seit 2â Jahren der Nachsorge kein Wiederauftreten von Nierensteinen mehr erlebt hat.Physiologische Charakterisierung der Variantenum die Pathogenität der SLC26A6 p.R507W-Mutation zu beurteilen, untersuchten wir als nächstes ihre Wirkung auf die Proteinexpression, den Proteintransport und den chloridabhängigen Oxalattransport. Unter physiologischen Bedingungen vermittelt die apikale Membran SLC26A6 in Epithelzellen die Oxalatsekretion, indem sie in Richtung des Austauschs von intrazellulärem Oxalat gegen extrazelluläres Chlorid wirkt. SLC26A6 kann jedoch abhängig von der Richtung der nettotreibenden Kraft den clâˆ -Oxalataustausch in beide Richtungen vermitteln.

Wir haben die clâˆ -gradientenstimulierte 14C-Oxalataufnahme als Maß für die Oxalattransportaktivität gemessen, die durch menschliches SLC26A6 vermittelt wird, das in OKP-Epithelzellen transfiziert wurde, wie in früheren Studien mit SLC26A6-Glykosylierungsmutanten.19 Wir untersuchten speziell die chloridabhängige Komponente der 14C-Oxalataufnahme, die durch die transfizierten humanen SLC26A6-Expressionskonstrukte vermittelt wurde, indem wir den endogenen Oxalattransport korrigierten (siehe Methoden und ergänzende Online-Abbildung S3 für Details).Die R507W-Mutation beeinträchtigt direkt die chloridabhängige Oxalattransportfähigkeit in menschlichem SLC26A6. Die anfängliche Charakterisierung der Î507-Mutation deutete darauf hin, dass der Grad der Hemmung der Slc26a6-vermittelten chloridabhängigen Oxalattransportaktivität signifikant höher war als der, der allein durch eine verminderte Proteinexpression vorhergesagt wurde. Um diese Möglichkeit besser zu adressieren, transfizierten wir OKP-Zellen mit 2,5 Ã mehr Mutanten (MT) als Wildtyp (WT) human SLC26A6 (hA6), um die scheinbare Transportaktivität von Î 507-HA6 signifikant zu verbessern. Die Zellen wurden entweder mit 0,25âÂµg HA-MT (MT) oder 0,1âÂµg HA-WT (WT) cDNA pro Vertiefung einer 24-Well-Platte transfiziert. Die Experimente wurden durchgeführt und die Daten identisch wie in den Panels Aâ C von Abbildung 1 dargestellt.

Expressionsniveaus von insgesamt und Zelloberfläche biotinylierbarem hA6. Die Expressionsniveaus wurden densitometrisch bestimmt. Alle WT-Werte werden als 100 (%) ausgedrückt, und die einzelnen MT-Werte variieren entsprechend. Tafel D. Chloridabhängige 14C-Oxalat-Aufnahme zurückzuführen auf transfizierten Wildtyp (WT.

HA-WT) und Mutante (MT. HA-MT) Slc26a6. Das Hauptziel dieses Experiments war es, die Transportfähigkeit der Mutante relativ zum Wildtyp Slc26a6 unabhängig von der Proteinexpression direkt zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden die in Tafel D dargestellten Transportdaten für jede Transfektion auf biotinylierbares hA6 an der Zelloberfläche normalisiert. Tx, Transfektion.

Utx, nicht transfiziert." data-icon-position data-hide-link-title="0">Abbildung 3 Die R507W-Mutation beeinträchtigt direkt die chloridabhängige Oxalattransportfähigkeit in menschlichem SLC26A6. Die anfängliche Charakterisierung der Î507-Mutation deutete darauf hin, dass der Grad der Hemmung der Slc26a6-vermittelten chloridabhängigen Oxalattransportaktivität signifikant höher war als der, der allein durch eine verminderte Proteinexpression vorhergesagt wurde. Um diese Möglichkeit besser zu adressieren, transfizierten wir OKP-Zellen mit 2,5 Ã mehr Mutanten (MT) als Wildtyp (WT) human SLC26A6 (hA6), um die scheinbare Transportaktivität von Î 507-HA6 signifikant zu verbessern. Die Zellen wurden entweder mit 0,25âÂµg HA-MT (MT) oder 0,1âÂµg HA-WT (WT) cDNA pro Vertiefung einer 24-Well-Platte transfiziert. Die Experimente wurden durchgeführt und die Daten identisch wie in den Panels Aâ C von Abbildung 1 dargestellt.

Utx, nicht transfiziert.Die Charakterisierung der Wirkung der p.R507W-Mutation auf die Expression und Funktion von menschlichem SLC26A6, das in OKP-Zellen transfiziert wurde, ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Ergebnisse sind für drei unabhängige Experimente dargestellt, in denen OKP-Zellen mit identischen Mengen an cDNA transfiziert wurden, die für die WT- und Mutanten (MT) -Transporter kodieren. Abbildung 2A zeigt Immunblots von Gesamtzelllysat und verglich transfizierte Zellen mit einer nicht transfizierten Kontrollspur. Die Transfektion von OKP-Zellen führt zur Expression einer Nebenbande knapp unter 75âkDa und mehrerer prominenter Banden >100âkDa. Wie in einer früheren Studie gezeigt, entspricht die untere Bande der Größe von nascierendem unglykosyliertem SLC26A6, während die oberen Banden komplexglykosyliertem SLC26A6 entsprechen.19 Oberflächenbiotinyliertes SLC26A6 ist in Abbildung 2B dargestellt und entspricht in seiner Größe den komplexglykosylierten Formen von SLC26A6.

Wie durch die Immunoblots in Abbildung 2A und B veranschaulicht und durch die Densitometrie in Abbildung 2C zusammengefasst, gab es eine deutliche Verringerung der glykosylierten und Zelloberflächenexpression des Mutantentransporters im Vergleich zu WT. Obwohl diese Ergebnisse darauf hindeuten, dass die p.Die R507W-Mutation führt zu verminderter Verarbeitung und Transport und / oder erhöhtem Abbau des Transporters. Die qualitative Ähnlichkeit der Western Blot-Molekulargewichtsbandenprofile der WT- und MT-Konstrukte deutet stark darauf hin, dass die Mutation die Glykosylierung von SLC26A6 an sich nicht direkt beeinflusst. Wie in Abbildung 2D gezeigt, war die chloridabhängige 14C-Oxalataufnahme, die durch die Mutante SLC26A6 vermittelt wurde, ebenfalls deutlich beeinträchtigt. Interessant ist, dass die Mutation zu einer etwa 50% igen Verringerung der Zelloberflächenexpression von SLC26A6 führte (Abbildung 2C), aber zu einer überproportional höheren Verringerung der clâˆ -abhängigen Oxalattransportaktivität von etwa 75%.

Dies deutet darauf hin, dass die Mutation sowohl die Expression als auch die intrinsische Transportfähigkeit von SLC26A6 beeinflussen könnte.Wir haben daher als nächstes ein Experiment entworfen, um direkt zu testen, ob die Mutation zusätzlich zu dem in Abbildung 2 gezeigten Defekt in der Nettooberflächenexpression einen Defekt in der intrinsischen Transportfunktion von SLC26A6 verursacht. Zellen wurden mit 2,5-fach mehr Mutanten- als WT-cDNA transfiziert, mit dem Ziel, die Oberflächenexpression der Mutanten- und WT-Transporter annähernd auszugleichen. Wie durch die Immunoblots in Abbildung 3A und B veranschaulicht und durch die Densitometrie in Abbildung 3C zusammengefasst, erreichte das Protokoll ungefähr äquivalente Mengen der glykosylierten und oberflächenexprimierten Formen der Mutanten- und WT-Transporter. Am wichtigsten ist, dass die Bewertung der Transportaktivität, normalisiert auf die Oberflächenexpression, wie in Abbildung 3D gezeigt, darauf hinweist, dass die p.Die R507W-Mutation verursacht tatsächlich einen deutlichen Defekt (ungefähr 50%) der intrinsischen Transportaktivität von SLC26A6. Die Ergebnisse der Abbildungen 2 und 3 zusammengenommen deuten darauf hin, dass der 75% ige Defekt in der Transportaktivität der Mutante im Vergleich zu WT SLC26A6, wenn gleiche Mengen an cDNA transfiziert werden (Abbildung 2D), aus einem etwa 50% igen Defekt in der Zelloberflächenexpression (Abbildung 2C) und einem etwa 50% igen Defekt resultiert intrinsische Transporteraktivität (Abbildung 3D).Angesichts der Tatsache, dass Transporter der SLC26-Familie als Dimere existieren,18 24 Wir haben zusätzliche Studien durchgeführt, um die Möglichkeit einer dominanten negativen Wirkung des p zu testen.R507W-Mutation bei Expression des WT-Transporters.

Unser Ansatz bestand darin, die Expression von myc-markiertem WT SLC26A6 als Funktion der Cotransfektion mit entweder HA-markiertem WT oder HA-markiertem Mutantentransporter zu testen. Wir wählten Transfektionsbedingungen, um äquivalente Expressionsniveaus von HA-WT und HA-MT SLC26A6 zu erreichen (Online-Ergänzungsabbildung S4). Wie durch die Immunoblots in Abbildung 4A und B veranschaulicht und durch die Densitometrie in Abbildung 4C zusammengefasst, verursachte die Coexpression der Mutante SLC26A6 eine 70% ige Reduktion der glykosylierten und Zelloberflächenexpression von myc-markiertem WT SLC26A6 im Vergleich zur Coexpression von WT SLC26A6. Diese Ergebnisse unterstützen die Möglichkeit, dass die p.R507W-Mutation einen dominanten negativen Effekt auf die Expression des WT-Transporters haben kann, so dass der Hyperoxalurie-Phänotyp von Patienten, die für diese Mutation heterozygot sind, schwerwiegender sein kann als allein durch Haploinsuffizienz vorhergesagt.Die Koexpression der R507W-Mutante reduziert sowohl die Gesamt- als auch die Zelloberflächenexpression des Wildtyps SLC26A6 signifikant. OKP-Zellen wurden mit 0,1âÂµg myc-markierter humaner SLC26A6 (myc-WT) cDNA und entweder 0,1âÂµg HA-markierter Wildtyp-Slc26a6 (HA-WT) cDNA oder 0,25âÂµg HA-markierter Arg507Trp-Mutante Slc26a6 (HA-MT) cDNA pro Vertiefung einer 24-Well-Schale kotransfiziert.

Die Cotransfektionsbedingungen wurden ausgewählt, um äquivalente Expressionsniveaus jedes HA-markierten cDNA-Konstrukts zu erreichen, um einen direkten Vergleich der Auswirkungen der Coexpression jedes Proteins zu erleichtern. Die Zellen wurden 72 Stunden nach der Transfektion getestet. Siehe ergänzende Online-Abbildung S3 für ein repräsentatives Cotransfektionsexperiment, das die gleichzeitige Expression jedes epitopmarkierten Konstrukts veranschaulicht. Panel A. Westliche Analyse der myc-markierten Wildtyp-Slc26a6-Expression in Gesamtzelllysaten, die aus jeder Cotransfektion isoliert wurden.

Panel B. Western-Analyse von biotinylierbarem myc-markiertem Slc26a6 an der Zelloberfläche aus jeder Cotransfektion. Die in den Feldern A+B dargestellten Western Blots wurden mit einem monoklonalen Maus-Anti-Myc-Antikörper (Thermo Fisher R950-25. Verdünnung 1:5000) untersucht. Tafel C.

Expressionsniveaus von Gesamt- und Zelloberflächen-biotinylierbarem myc-markiertem Slc26a6. Die Expressionsniveaus wurden densitometrisch bestimmt. Um Vergleiche zwischen Transfektionen (n = 4 unabhängige Transfektionen) zu erleichtern, wurden die myc-WT. HA-MT-Cotransfektions-Expressionsniveaus relativ zu den Densitometriewerten für myc-WT. HA-WT-Cotransfektions-Expressionsniveaus für jede Transfektion ausgedrückt und die myc-WT.

HA-WT-Cotransfektions-Expressionsniveaus wurden auf einen Mittelwert von 100 (%) normalisiert. Co-IP, Koimmunpräzipitation. Co-Tx, Cotransfektion. IP, Immunpräzipitation. Tx, Transfektion.

Utx, nicht transfiziert." data-icon-position data-hide-link-title="0">Abbildung 4 Die Koexpression der R507W-Mutante reduziert sowohl die Gesamt- als auch die Zelloberflächenexpression des Wildtyps SLC26A6 signifikant. OKP-Zellen wurden mit 0,1âÂµg myc-markierter humaner SLC26A6 (myc-WT) cDNA und entweder 0,1âÂµg HA-markierter Wildtyp-Slc26a6 (HA-WT) cDNA oder 0,25âÂµg HA-markierter Arg507Trp-Mutante Slc26a6 (HA-MT) cDNA pro Vertiefung einer 24-Well-Schale kotransfiziert. Die Cotransfektionsbedingungen wurden ausgewählt, um äquivalente Expressionsniveaus jedes HA-markierten cDNA-Konstrukts zu erreichen, um einen direkten Vergleich der Auswirkungen der Coexpression jedes Proteins zu erleichtern. Die Zellen wurden 72 Stunden nach der Transfektion getestet. Siehe ergänzende Online-Abbildung S3 für ein repräsentatives Cotransfektionsexperiment, das die gleichzeitige Expression jedes epitopmarkierten Konstrukts veranschaulicht.

Panel A. Westliche Analyse der myc-markierten Wildtyp-Slc26a6-Expression in Gesamtzelllysaten, die aus jeder Cotransfektion isoliert wurden. Tafel B. Westliche Analyse von biotinylierbarem myc-markiertem Slc26a6 an der Zelloberfläche aus jeder Cotransfektion. Die in den Feldern A+B dargestellten Western Blots wurden mit einem monoklonalen Maus-Anti-Myc-Antikörper (Thermo Fisher R950-25.

Verdünnung 1:5000) untersucht. Tafel C. Expressionsniveaus von Gesamt- und Zelloberflächen-biotinylierbarem myc-markiertem Slc26a6. Die Expressionsniveaus wurden densitometrisch bestimmt. Um Vergleiche zwischen Transfektionen (n = 4 unabhängige Transfektionen) zu erleichtern, wurden die myc-WT.

HA-MT-Cotransfektions-Expressionsniveaus relativ zu den Densitometriewerten für myc-WT ausgedrückt:Die HA-WT-Cotransfektions-Expressionsniveaus für jede Transfektion und myc-WT. Die HA-WT-Cotransfektions-Expressionsniveaus wurden auf einen Mittelwert von 100 (%) normalisiert. Co-IP, Koimmunpräzipitation. Co-Tx, Cotransfektion. IP, Immunpräzipitation.

Tx, Transfektion. Utx, nicht transfiziert.Als nächstes führten wir eine Reihe von WT / MT-Co-Immunpräzipitationsstudien durch, um die Assoziation von MT mit WT-Transporter zu verifizieren und den dominant negativen Phänotyp zu erklären. OKP-Zellen wurden mit myc-markiertem WT SLC26A6 und entweder HA-markiertem WT SLC26A6 oder HA-markiertem MT SLC26A6 kotransfiziert, wie für das in Abbildung 4 beschriebene Experiment beschrieben. Die Zellen wurden mit 1% Digitonin solubilisiert, einer Immunpräzipitation mit einem Anti-myc-Antikörper unterzogen, und die resultierenden Immunpräzipitate wurden durch SDS-PAGE und Western Blot mit Antikörpern analysiert, die entweder gegen den Myc-Tag oder den HA-Tag gerichtet waren (Abbildung 5).Die R507W-Substitution hemmt die Assoziation von MT-A6 mit WT-A6 nicht. Das Hauptziel dieses Experiments war es zu bestimmen, ob die p.R507W-Mutation die Fähigkeit der resultierenden Mutante beeinflusst, mit Wildtyp (WT) Slc26a6 zu assoziieren und den prototypischen Multimerkomplex Slc26a6 zu bilden.

Durch die Verwendung verschiedener Epitop-Tags für die potenziellen Bindungspartner verwendeten wir die primäre Immunpräzipitation von Anti-Myc-Tags (WT), um die Assoziation mit HA-markierten Protomeren (WT + MT) durch Überwachung der Coimmunpräzipitationsniveaus zu bewerten. OKP-Zellen wurden wie in Abbildung 3 beschrieben cotransfiziert (Co-Tx), mit 1% Digitonin solubilisiert und einer Immunpräzipitation mit einem monoklonalen Maus-Anti-Myc-Antikörper (Thermo Fisher R950-25. 5â Âµg IgG/mL Lysat) unterzogen. Panel A. Westliche Analyse der myc-markierten WT-Slc26a6-Expression in Gesamtzelllysaten, die aus jeder Cotransfektion isoliert wurden.

Tafel B. Westliche Analyse der HA-markierten Slc26a6-Expression in Gesamtzelllysaten, die aus jeder Cotransfektion isoliert wurden. Panel C. Westliche Analyse von primärem immunpräzipitiertem myc-markiertem WT Slc26a6 aus jeder Cotransfektion. Panel D.

Westliche Analyse von coimmunpräzipitiertem HA-markiertem Slc26a6 aus jeder Cotransfektion. Westernblots, die in den Feldern A + C dargestellt sind, wurden mit dem Anti-Myc-Antikörper R950-25 (Verdünnung 1. 5000) und die in den Feldern B + D mit dem Anti-HA-Antikörper 71â 5500 (Verdünnung 1. 50) untersucht. Tafel E.

Relative Expression von primärem immunpräzipitiertem myc-markiertem WT Slc26a6 und coimmunpräzipitiertem HA-markiertem WT oder Mutant Slc26a6. Die Expressionsniveaus wurden densitometrisch bestimmt. Um Vergleiche zwischen Cotransfektionen (n = 3 individuelle Cotransfektionsereignisse. Tx-1 bis Tx-3) zu erleichtern, wurden die Proteinexpressionsniveaus, die für die myc-WT / HA-MT-Cotransfektionsbedingung bestimmt wurden, relativ zu den Densitometriewerten für die myc-WT / HA-WT-Cotransfektionsbedingung für jedes Experiment ausgedrückt, und die myc-WT. HA-WT-Cotransfektionsexpressionsniveaus wurden auf 100 (%) normalisiert.

*Nicht signifikant unterschiedlich bei p=0.3566. Tx, Transfektion. Utx, nicht transfiziert." data-icon-position data-hide-link-title="0">Abbildung 5 Die R507W-Substitution verhindert nicht die Assoziation von MT-A6 mit WT-A6. Das Hauptziel dieses Experiments war es zu bestimmen, ob die p.R507W-Mutation die Fähigkeit der resultierenden Mutante beeinflusst, mit Wildtyp (WT) Slc26a6 zu assoziieren und den prototypischen Multimerkomplex Slc26a6 zu bilden. Durch die Verwendung verschiedener Epitop-Tags für die potenziellen Bindungspartner verwendeten wir die primäre Immunpräzipitation von Anti-Myc-Tags (WT), um die Assoziation mit HA-markierten Protomeren (WT + MT) durch Überwachung der Coimmunpräzipitationsniveaus zu bewerten.

OKP-Zellen wurden wie in Abbildung 3 beschrieben cotransfiziert (Co-Tx), mit 1% Digitonin solubilisiert und einer Immunpräzipitation mit einem monoklonalen Maus-Anti-Myc-Antikörper (Thermo Fisher R950-25. 5â Âµg IgG/mL Lysat) unterzogen. Panel A. Westliche Analyse der myc-markierten WT-Slc26a6-Expression in Gesamtzelllysaten, die aus jeder Cotransfektion isoliert wurden. Tafel B.

Westliche Analyse der HA-markierten Slc26a6-Expression in Gesamtzelllysaten, die aus jeder Cotransfektion isoliert wurden. Panel C. Westliche Analyse von primärem immunpräzipitiertem myc-markiertem WT Slc26a6 aus jeder Cotransfektion. Panel D. Westliche Analyse von coimmunpräzipitiertem HA-markiertem Slc26a6 aus jeder Cotransfektion.

Westernblots, die in den Feldern A + C dargestellt sind, wurden mit dem Anti-Myc-Antikörper R950-25 (Verdünnung 1. 5000) und die in den Feldern B + D mit dem Anti-HA-Antikörper 71â 5500 (Verdünnung 1. 50) untersucht. Tafel E. Relative Expression von primärem immunpräzipitiertem myc-markiertem WT Slc26a6 und coimmunpräzipitiertem HA-markiertem WT oder Mutant Slc26a6.

Die Expressionsniveaus wurden densitometrisch bestimmt. Um Vergleiche zwischen Cotransfektionen (n = 3 individuelle Cotransfektionsereignisse. Tx-1 bis Tx-3) zu erleichtern, wurden die Proteinexpressionsniveaus, die für die myc-WT / HA-MT-Cotransfektionsbedingung bestimmt wurden, relativ zu den Densitometriewerten für die myc-WT / HA-WT-Cotransfektionsbedingung für jedes Experiment ausgedrückt, und die myc-WT. HA-WT-Cotransfektionsexpressionsniveaus wurden auf 100 (%) normalisiert. *Nicht signifikant unterschiedlich bei p=0.3566.

Tx, Transfektion. Utx, untransfected.As die im vorherigen Experiment beobachtete Cotransfektion von mutiertem HA-A6 mit Wildtyp-Myc-A6 (Abbildung 4) führte zu einer dramatischen Abnahme der Expression von reifem WT-Myc-A6 sowohl im solubilisierten Lysat (Abbildung 5A) als auch in der primären Begleitimmunpräzipitation (Abbildung 5C). Die westliche Analyse des solubilisierten Lysats mit dem Anti-HA-Antikörper (Abbildung 5B) bestätigte, dass die Cotransfektion mit 2,5 Ã HA-MT relativ zu HA-WT zu ungefähr ähnlichen Expressionsniveaus der beiden HA-markierten SLC26A6-Expressionskonstrukte führte. Wir beobachteten eine signifikante Koimmunpräzipitation sowohl des Wildtyps als auch des mutierten HA-A6 mit dem myc-markierten WT-A6 (Abbildung 5D). Trotz des Vorhandenseins ähnlicher Mengen an HA-WT und HA-MT in den anfänglichen Zelllysaten für jedes Experiment (Abbildung 5B) konnten ihre relativen Wiederfindungen durch Koimmunpräzipitation bestenfalls nur die relative Wiederfindung des primären immunpräzipitierten Bindungspartners (myc-WT) widerspiegeln.

Wenn die beiden Konstrukte mit Wildtyp-SLC26A6 mit ähnlicher Wirksamkeit multimerisieren, sollten ihre relativen Wiederfindungsraten durch Koimmunpräzipitation eng mit der relativen Wiederfindungsrate von myc-WT in der primären Immunpräzipitation für jede Transfektionsbedingung übereinstimmen. Die scheinbare Abnahme der Koimmunpräzipitation von HA-MT im Vergleich zu HA-WT, die in Abbildung 5D beobachtet und in Abbildung 5E quantifiziert wurde, unterscheidet sich nicht signifikant von der, die für die primäre Immunpräzipitation von myc-WT beobachtet wurde, die in Abbildung 5B beobachtet wurde, wenn sie mit HA-WT im Vergleich zu HA-MT kotransfiziert wurde. Dies deutet stark darauf hin, dass die p.Die R507W-Mutation beeinträchtigt die Wirksamkeit der Bildung des multimeren SLC26A6-Komplexes an sich nicht. Der Nachweis der Bildung von MT / WT-Heteromultimeren kann den dominanten negativen Effekt des MT-Transporters erklären, wenn er fehlgefaltet ist, eine veränderte Stabilität in der Plasmamembran aufweist und / oder eine verringerte Oxalattransportfähigkeit aufweist.Identifizierung zusätzlicher schädlicher Slc26a6-Mutationen in Fällen mit nl aus der UK Biobank Als nächstes analysierten wir bis zu 200â 619 Proben mit verfügbaren Exomsequenzierungsdaten in der UK Biobank. Leider war NL in den Phänotypen der britischen Biobank nicht gut erfasst, da wir 5267 Patienten mit aufgezeichneter NL identifizierten, was einer Prävalenz von nur 2% entspricht.

Diese Prävalenz ist sehr weit von der bekannten Prävalenz von NL in Großbritannien (13%) entfernt.25 Nach einem Nur-Fall-Design fanden wir zwei heterozygote proteinverkürzende SLC26A6-Mutationen (NM_022911.3:c. 3G>A/p.Met1?. und NM_022911.3:c.1132C>T/p.Gln378*) bei zwei Männern. Diese beiden Mutationen waren bei GnomAD sehr selten (mit einer geringen Allelhäufigkeit <0,00005). Diese beiden zusätzlichen unabhängigen Fälle unterstützen einen möglichen Beitrag von SLC26A6-Funktionsverlustmutationen zu NL.

Leider gehört die Oxalatausscheidung im Urin nicht zu den Urinparametern, die im Phänotyp der britischen Biobank verfügbar sind.Diskussionwir zeigen komplementäre genetische und funktionelle Beweise für einen neuartigen Mechanismus der vererbten enterischen Hyperoxalurie beim Menschen. Mithilfe einer Kandidatengenanalyse von Daten aus der Ganzexomsequenzierung identifizierten wir eine seltene c.1519C& gt. T-Mutation im SLC26A6-Gen, die für einen Oxalattransporter in einer von Hyperoxalurie betroffenen Familie kodiert. Diese Mutation führt zur Substitution des Arginins in Position 507 durch ein Tryptophan. Eine weitere umfangreiche In-vitro-Charakterisierung ergab, dass die Mutation sowohl die SLC26A6-Transportfunktion als auch die Membranexpression verringert.

Darüber hinaus übt das mutierte Allel auch einen tiefgreifenden dominanten negativen Effekt auf das WT-Allel aus, was darauf hindeutet, dass die Mutation die SLC26A6-vermittelte Oxalatsekretion stärker beeinflussen könnte als die Genhaploinsuffizienz allein.Die Ergebnisse unserer Experimente zeigen, dass die Koexpression von Mutante und WT SLC26A6 die Gesamt- und Zelloberflächenexpression des WT-Proteins verringert, dass Mutante SLC26A6 in der Lage ist, multimere Strukturen mit WT SLC26A6 zu bilden, und dass das Vorhandensein eines Tryptophans in Position 507 die Wechselwirkung des mutierten SLC26A6-Monomers mit der Lipiddoppelschicht destabilisieren soll legen nahe, dass potenzielle Mutantenâ mutierte Homodimere und Mutantenâ Wildtyp-Heterodimere sind beide sehr wahrscheinlich instabil in der Zellplasmamembran. Es ist zu erwarten, dass die dominant-negative Wirkung der Mutante SLC26A6 auf das im Heterodimer (WT / MT SLC26A6) assemblierte Wildtypprotein in Kombination mit der inhibitorischen Wirkung der im Homodimer (MT / MT SLC26A6) exprimierten Mutation selbst die Produktion von funktionellem SLC26A6 in der Plasmamembran um viel mehr als die von der heterozygoten Mutation vorhergesagten 50% verringert.SLC26A6 ist ein Anionenaustauscher aus der Familie der gelösten Träger 26, der an der apikalen Membran vieler Arten von Epithelzellen, einschließlich Enterozyten im Gastrointestinaltrakt, exprimiert wird.26 Es kann intrazelluläres Oxalat gegen externes Chlorid austauschen und führt daher eine apikale Oxalatsekretion durch.27 Der Oxalattransport durch das Darmepithel resultiert aus der Kombination von passiver parazellulärer Absorption und aktiver transzellulärer Sekretion.28 Mausstudien haben gezeigt, dass SLC26A6 eine entscheidende Rolle bei der intestinalen Sekretion von Oxalat spielt.12 13 Daher erhöht die Inaktivierung von Slc26a6 bei Mäusen die Nettooxalatabsorption, was zu einem höheren Plasmaoxalat und letztendlich zu einer erhöhten Oxalatausscheidung im Urin führt, insbesondere wenn die Oxalataufnahme über die Nahrung hoch ist.12 Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die c.1519C>T / p.R507W-Mutation in SLC26A6 eine ähnliche Pathophysiologie verursachen kann, die beim Menschen zu enterischer Hyperoxalurie führt. In diesem Zusammenhang fällt auf, dass die patientâ s Hyperoxalurie durch Zugabe von Kalzium zu ihrer Ernährung dramatisch reduziert wurde, was stark darauf hindeutet, dass Hyperoxalurie in ihrem Fall hauptsächlich enterischen Ursprungs war und durch Behandlungen kontrolliert werden kann, die die passive parazelluläre Absorption begrenzen von Oxalat.Vier frühere Studien haben die mögliche Assoziation von SLC26A6-Mutationen mit Hyperoxalurie und Calciumoxalat-Urolithiasis untersucht:In der ersten Studie untersuchten die Autoren eine Kohorte von 94 Patienten mit PH und 96 Kontrollen.14 Die nicht-synonymen SLC26A6-Varianten, die in Fällen nachgewiesen wurden, waren tatsächlich häufig (geringe Allelhäufigkeit â¥ 1%) in einer oder mehreren Populationen aus dem GnomAD-Browser (v2.1.1). Eine c.616G>A (p.V206M)-Mutante war am häufigsten (11%) und zeigte eine 30% ige Reduktion der Oxalattransportaktivität. Die Heterozygotie für diese Variante hatte jedoch keinen Einfluss auf die Plasma- oder Urinoxalatspiegel in der Studienpopulation.

Es gab keinen signifikanten Effekt irgendeiner identifizierten Variante auf die Oxalatausscheidung. P.Die V206M-Variante von SLC26A6 wurde anschließend in einer zweiten Studie beschrieben.15 Diese Variante war sehr häufig (geringe Allelhäufigkeit (MAF) ~10% in allen Populationen). Auch diese Variante war nicht mit Urolithiasis oder Hyperoxalurie assoziiert. In einer dritten Studie bewerteten Lu et al16 nicht-synonyme SLC26A6-Varianten, die in der öffentlichen Datenbank dbSNP gelistet waren, nach In-silico-Analysen funktionell. Die Autoren fanden einen signifikanten Zusammenhang zwischen der niederfrequenten (aber nicht seltenen) rs184187143-Variante (mit einem MAF von 0.4% in der finnischen Bevölkerung) und Urolithiasis-Risiko (unbereinigter p-Wert = 0,007).

Es wurden jedoch keine mechanistischen Erkenntnisse geliefert, die diesen Zusammenhang möglicherweise erklären könnten. Schließlich wurden kürzlich zwei weitere heterozygote Varianten von SLC26A6 berichtet.17 Die erste seltene p.R621G-Variante wurde bei einem Nicht-Steinbildhauer identifiziert, der eine normale (<40âmg/d) Oxalatausscheidung im Urin aufwies. Nach mehreren In-Silico-Programmen (PolyPhen, SIFT, Mutationstaster, Align GVGD) war diese Mutation völlig gutartig. Die zweite seltene p.Eine D674N-Variante, die die SLC26A6-Expression und den clâˆ -abhängigen Bikarbonattransport aufhob, wenn sie in HEK-Zellen transfiziert wurde, wurde bei einem Patienten mit Calciumoxalat-Urolithiasis identifiziert. Die Autoren berichteten jedoch nicht, ob diese Variante in der Familie des Patienten mit Lithiasis kosegregierte.

Darüber hinaus war die Mutation bei dem Probanden nicht mit Hyperoxalurie assoziiert, sondern mit einer ausgeprägten Hypocitraturie, im Einklang mit früheren Studien derselben Gruppe, die zeigten, dass eine Mutation der STAS-Domäne von SLC26A6 eine Hypocitraturie hervorrufen kann, einen weiteren wichtigen Risikofaktor für NL, indem sie die Regulation des Citrat-Transporters NaDC-1.29 verändert 30 Bei unserem Patienten wurde auch eine sehr milde Hypocitraturie zusammen mit der ausgeprägten Hyperoxalurie beobachtet. Es ist sehr unwahrscheinlich, dass eine so leichte Abnahme der Citratausscheidung im Urin einen so häufig wiederkehrenden Steinkrankheitsverlauf verursachen könnte, aber es könnte zusammen mit Hyperoxalurie zu dem erhöhten Risiko für beigetragen haben NL.In zusammenfassung. Unsere Beobachtung, dass die Mutation p.R507W beim Menschen mit Hyperoxalurie assoziiert ist, stützt die Hypothese, dass SLC26A6 wie bei der Maus eine entscheidende Rolle bei der intestinalen Sekretion von Oxalat spielt, wodurch die Nettoabsorption von Oxalat aus der Nahrung begrenzt wird. In Übereinstimmung mit dieser mechanistischen Hypothese beobachteten wir einen vorteilhaften Effekt der Erhöhung des Kalziums in der Ernährung des Patientenâ s, um die enterische Oxalatabsorption und damit die Oxalatausscheidung im Urin zu reduzieren. Dementsprechend könnten andere Mutationen, die zu Funktionsstörungen des Oxalattransporters SLC26A6 führen, für die vererbte Form der enterischen Hyperoxalurie und NL bei menschlichen Patienten verantwortlich sein.

Daher sollte ein Screening auf Mutationen in SLC26A6 bei Patienten mit Hyperoxalurie durchgeführt werden, bei denen keine Mutationen in den PH-Krankheitsgenen AGXT, GRHPR oder HOGA gefunden wurden, oder bei Patienten mit enterischer Hyperoxalurie, bei denen keine Anzeichen einer Darmerkrankung vorliegen.Ergänzendes Materialdatenverfügbarkeitserklärungalle für die Studie relevanten Daten sind im Artikel enthalten oder werden als ergänzende Informationen hochgeladen. Nicht zutreffend.Ethikerklärungeneinverständniserklärung des Patienten zur Veröffentlichungeinverständniserklärung direkt von der Ethikgenehmigung des Patienten eingeholtdiese Studie umfasst menschliche Teilnehmer und wurde vom Institutional Review Board des Universitätsklinikums La RÃ © Union genehmigt (ID. 2019 / CHU / 10). Die Teilnehmer gaben vor der Teilnahme ihre Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie ab.Danksagungwir möchten der Patientin und ihrer Familie für ihre freundliche Hilfe und Teilnahme an der Studie danken. Wir möchten uns auch bei FrÃ© dÃ©ric Allegaert und Nicolas Larcher für die kompetente technische Unterstützung bedanken.

Diese Forschung wurde mit der britischen Biobank-Anwendung # 67 575 durchgeführt..

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